Cesar Doutorado Port

SERVIÇO DE ENDOCRINOLOGIA E METABOLOGIA
HOSPITAL DE CLÍNICAS
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

Tese de Doutorado (Ph.D.), defendida e aprovada no dia 03 de outubro de 1997

Research Centre for Endocrinology and Metabolism (RCEM)
Department of Internal Medicine
Sahlgrenska University Hospital
Göteborg, Sweden

O hormônio de crescimento humano (GH) consiste de várias isoformas. As múltiplas moléculas de GH se originam da produção através de dois genes distintos (GH-N: hipófise; GH-V: placenta), mecanismos alternativos de quebra do RNA mensageiro e eventos pós-translação. A isoforma mais abundante é representada por um polipetídeo com peso molecular de 22kDa com 191 aminoacidos. O 22kDa GH é o hormônio de referência e é com ele que as isoformas não-22kDa GH são comparadas com relação a estrutura química e atividade biológica.
O objetivo principal deste estudo foi examinar as implicações clínicas da heterogeneidade do GH. A reação cruzada de várias isoformas do hormônio foi testada em dois imunoensaios comerciais usados na dosagem de rotina do GH. Para estudar a proporção de isoformas não-22kDa GH no sangue humano, o ensaio de exclusão da isoforma 22kDa (Growth hormone Exclusion Assay, GHEA) foi desenvolvido e optimizado através de modelos estatísticos. O GHEA é baseado na extração sangüínea da forma 22kDa GH e determinação dos níveis das isoformas não-22kDa GH com o uso de um ensaio de GH com anticorpos policlonais. O GHEA foi utilizado para estudar a proporção das isoformas não-22kDa GH em crianças com crescimento normal e alterado, e em pacientes com acromegalia. Na placenta, duas novas transcrições do gene GH-V foram clonadas, predizindo uma possível produção de novas isoformas do GH pela placenta.
As diversas isoformas do GH testadas demonstraram diferenças marcantes de reação cruzada nos dois imunoensaios de GH. A proporção de não-22kDa GH, determinada através do GHEA, estava aumentada em pacientes com acromegalia e correlacionou-se com o tamanho do tumor. Após tratamento cirúrgico, a proporção de isoformas não-22kDa GH foi diferente em acromegálicos considerados curados do que naqueles considerados não curados, com os do primeiro grupo demonstrando normalização dos valores de isoformas não-22kDa GH. Em crianças pré-púberes sadias e estatura normal, a proporção de isoformas não-22kDa GH foi positivamente relacionada com avaliações auxológicas de composição corporal. Em meninos pré-púberes sadios e de estatura normal, proporções aumentadas de isoformas não-22kDa GH na circulação foram associadas com menor crescimento. A quantidade de isoformas não-22kDa GH estava aumentada em 5 de 17 meninas com Síndrome de Turner, em 5 de 25 crianças nascidas pequenas para a idade gestacional e em 4 de 24 crianças com baixa estatura idiopática. No gene GH-V, dois novos cDNAs foram clonados, um codificando uma forma 20kDa GH na placenta e outro codificando uma forma de 24kDa GH, que foi denominada de GH-V3, que apresenta a parte carboxi-terminal totalmente diferente daquela das formas 22kDa e 20kDa GH.
Concluindo, as isoformas não-22kDa GH podem estar presentes no sangue humano em quantidades bastante variáveis, o que contribui para as discrepâncias nas dosagens de GH por diferentes kits comerciais. Em crianças, a proporção circulante das isoformas não-22kDa GH podem ser de significância biológica nos mecanismos de cresciemento e na composição corporal. Em acromegalia, o novo ensaio GHEA foi útil no seguimento dos pacientes após tratamento cirúrgico para determinar os resultados terapêuticos. O gene GH-V placentário apresenta pelo menos quatro mecanismos de quebra de RNA mensageiro, predizindo em alguns casos a produção de isoformas de GH com uma porção carboxi-terminal totalmente diferente.

Human growth hormone (GH) consists of several isoforms. The multiple GH molecules arise from two related genes (GH-N: pituitary; GH-V: placenta), alternative m-RNA splicing mechanisms and posttranslational events. The most abundant GH is a 22kDa polypeptide with 191 amino acids. The 22kDa GH is the reference GH against which other non-22kDa GH isoforms are compared regarding chemical structure and biological activity.
The general aim of this study was to examine the clinical implications of the GH heterogeneity. The cross-reactivity of several GH isoforms was tested in two GH immunoassays. To study the proportion of non-22kDa GH isoforms in human blood, the 22kDa GH exclusion assay (GHEA) was developed and optimised by statistical designs. The GHEA is based on extraction of 22kDa GH from serum and determination of non-22kDa GH levels by a polyclonal GH assay. The GHEA was used to evaluate the proportion of non-22kDa GH in children with normal and abnormal growth, and in acromegaly. In placenta, two transcripts derived from the GH-V gene predicting novel GH isoforms were cloned.
GH isoforms showed marked differences in their cross-reactivity in the two GH immunoassays. Using the GHEA, the proportion of non-22kDa GH isoforms was increased in acromegalic men and correlated with tumour size. After surgery, the proportion of non-22kDa GH differed in acromegalics considered cured and those not cured, the former group showing normalisation of the values. In healthy prepubertal children, the proportion of non-22kDa GH was directly correlated to auxological estimates of body composition. In healthy prepubertal boys, high amounts of non-22kDa GH were associated with less growth. The amount of
non-22kDa GH was increased in 5 of 17 short girls with Turner syndrome, 5 of 25 short children born small for gestational age and 4 of 24 children with idiopathic short stature. In the GH-V gene, two cDNAs predicting new GH isoforms were cloned: one encoding a placental 20kDa GH and the other encoding a 24kDa GH, named GH-V3, with a unique carboxy-terminus.
In conclusion, non-22kDa GH isoforms can be present in human blood in highly variable amounts, contributing to discrepancies of GH measurements. In children, the circulating proportion of non-22kDa GH may be of biological significance for normal and abnormal growth, and for body composition. In acromegaly, the GHEA may be useful in the follow-up of the therapeutical outcome. The placental GH-V gene exhibits at least four different splicing pathways, predicting in some cases the expression of GH isoforms with distinct carboxy-termini.