Atividade dos receptores nucleares dos hormônios tireoideanos
e do ácido retinóico 9cis em diferentes elementos responsivos do DNA

Thyroid hormone and 9cis-retinoic acid  nuclear receptor activities
in different DNA responsive elements

Tese de Doutorado (Ph.D. thesis)

Hans Graf

Universidade Federal do Paraná (UFPR)

Professor Orientador: Dr Ralff Ribeiro (Universidade de Brasília)

Resumo

O receptor do hormônio tireoideano (TR) e o receptor do retinóide X (RXR) fazem parte de uma superfamília de receptores nucleares, que em resposta aos seus respectivos ligantes, atuam como fatores de transcrição no DNA. Os receptores nucleares possuem uma estrutura modular e a ligação dos mesmos ao DNA se faz como monômeros ou dímeros através do módulo ligador ao DNA (DBD) que se liga a seqüências nucleotídicas específicas do DNA, conhecidas como elementos responsivos hormonais (HRE). TR e RXR se ligam a HREs conhecidos como repetições diretas (DRs) do hexâmero AGGTCA (AGGTCAnAGGTCA). T3 e o ácido 9cis-retinóico se ligam a porção carboxi-terminal do TR e RXR respectivamente, ativando a transcrição gênica. O TR atua principalmente como homodímero ou heterodímero, ligando-se no último caso ao RXR.  Nosso estudo analisou a ligação do TR e do RXR a um grupo de DRs separadas por um número variável de nucleotídeos, de 0 a 6, com o objetivo de estabelecer a importância desses HREs na transcrição gênica destes receptores nucleares. Confirmamos através de cultura de células e eletroforese em gel de poliacrilamida que o espaçamento ideal para a resposta do T3 mediada pelo TR é de 4 nucleotídeos (DR4). A forscolina, um potencializador da proteína cinase A (PKA), foi capaz de potencializar a resposta transcricional do TR ao T3.  O RXR pode atuar como parceiro silencioso de outros receptores nucleares, ou como homodímero em resposta ao ácido 9cis-retinóico. Nossos ensaios de eletroforese demonstraram que o RXR pode se ligar como homodímero não só ao conhecido elemento responsivo DR1, mas também a DR2, DR3, DR4, DR5 e DR6, numa forma dependente de 9cisRA. Em cultura de células a forscolina demonstrou uma evidente ação sinérgica do RXR nos elementos DR1 a DR5. Desta forma, demonstramos que homodímeros de RXR podem possuir uma atividade transcricional mais ampla do que se acreditava e verificamos a importância de mecanismos de conversa cruzada entre os receptores nucleares TR e RXR com o sistema de sinalização via AMP cíclico.

Abstract

Thyroid hormone receptor (TR) and retinoid X receptor (RXR) belong to the nuclear receptor superfamily, which in response to their respective ligands, act as transcriptional factors at the DNA level. Nuclear receptors have a modular structure and their binding to DNA occurs as monomers or dimers through the DNA binding domain (DBD), which, in turn, binds to specific nucleotide sequences, known as hormone responsive elements (HREs). TR and RXR bind to HREs known as direct repeats (DRs) of the hexamer AGGTCA (AGGTCAnAGGTCA). Triiodothyronine and 9cis-retinoid acid bind to the carboxi-terminal of TR and RXR respectively, which modifies these receptors to regulate gene transcription. TR acts mainly as a homodimer or heterodimer with RXR. The aim of the present study was to analyze the binding of TR and RXR to a group of DRs, separated by a variable number of nucleotides, from 0 to 6, in order to determine the importance of these HREs on the transcriptional activity of these receptors. We have confirmed through cell culture and polyacrylamide gel electrophoresis that the ideal spacing for the T3 response mediated by TR is 4 nucleotides (DR4). Forskolin, a protein kinase A (PKA) stimulator, was able to enhance the transcriptional response of TR to T3. RXR can act as a silent partner of other nuclear receptors or as a homodimer in response to 9cis-retinoid acid. Our gel mobility assays showed that RXR can bind as a homodimer not only to the known hormone response element DR1, but also to DR2, DR3, DR4, DR5 and DR-6, in a  9cis-dependent fashion. In cell cultures, forskolin and 9cis activated in a sinergistic fashion RXR on elements DR1 to DR5. From this perspective, we have demonstrated that RXR homodimers have a wider transcriptional activity than previously suggested and that important crosstalks occur between the nuclear receptors TR and RXR with cyclic AMP signaling pathway.